УДК 619:616.3

Разработка реакции иммунотурбидиметрии для детекции антител к микроорганизмам рода Pasteurella.

Афонюшкин В.Н., (ГНУ ИЭВСиДВ CO Россельхозакадемии)  

Зубрицкая И.А. (МСХА CO Россельхозакадемии)

Широкая гостальная специфичность возбудителя пастереллеза серьезно усложняет применение современных технологий для серомониторинга. Большинство существующих методов серодиагностики пастереллеза основаны на методе ИФА. Однако в большинстве случаев ИФА тест-системы предназначены для обнаружения специфических антител у животных одного вида. Методы иммунотурбидиметрии основаны на преципитации комплекса антиген-антитело, соответственно отпадает необходимость в использовании коньюгатов, метод довольно прост в постановке.

Материалы и методы

Диализ проводили с использованием диализных нитроцеллюлезных мембран с проницаемостью пор ниже 10 кДа, высаливание проводили по стандартной методике растворами аммония сернокислого различного насыщения.

Иммунотурбидиметрию проводили в 96 луночных планшетах, реакцию учитывали фотометрией на планшетном вертикальном спектрофотометре «Tecan sunrise» с использованием светофильтров 405, 450, 520, 490 нм.

Для выделения антигена Pasteurella multocida использовали вакцину инактивированную, гидроокисальминиевую содержащую антигены Pasteurella multocida серотипов A, B, C, D.

В реакции использовали контрольные сыворотки полученные путем гипериммунизации морских свинок пастереллами различных серотипов и, в качестве отрицательного контроля, Bordetella avium

Результаты собственных исследований.

Получение антигена из вакцинного препарата проводилось следующим образом: 1-удаление алюмокалиевых квасцов с использованием диализа против 0,1М фосфатносолевого буфера, 2- растворение и последующий рефолдинг антигена с использованием 8М мочевины, 3-удаление нерастворившихся белков центрифугированием.

Получившийся препарат «нативных белков» Pasteurella multocida  подвергали последовательному высаливанию растворами сернокислого аммония с различной степенью насыщения. Полученные фракции очищали от сернокислого аммония путем диализа.

Исследование различных фракций антигенов выделенных из вакцины показало, что наиболее специфичное взаимодействие с положительной контрольной сывороткой наблюдается при использовании первой фракции, полученной путем высаливания сернокислым аммонием с 25% степенью насыщения (см. рис. 1 и табл.1).

Рис 1. Оптическая плотность реакций различных фракция антигеном ПМ с положительной и отрицательной контрольными сыворотками при 650нм.

Определенное влияние на специфичность сигнала оказывает и степень разбавления антигенов.  Например, нативный антиген, являясь изначально неконцентрированным, реагировал в разведении не более чем 1:2. В то же время неразбавленный антиген первой фракции способен давать неспецифические реакции с отрицательными сыворотками (см. табл. 1).

Таблица 1 S/P соотношение реакции при использовании различных фракций антигенов Pasteurella multocida и светофильтров.

разведение антигенов	фракция 1	фракция 2	фракция 3	фракция 4	нативный АГ
Длинна волны 620нм
1:2	1,023392	1,111111	1,139535	1,093023	1,343434
1:4	1,666667	1,22619	1,308642	0,568047	0,34106
Длинна волны 492нм
1:2	0,969231	0,910377	0,89	0,845	1,189189
1:4	1,415323	1,104167	1,15508	0,697761	0,831804
Длинна волны 450нм
1:2	0,983871	0,893204	0,861111	0,813149	1,170886
1:4	1,365994	1,118705	1,167286	0,764368	1,056757

В процессе отработки реакции наибольшая линейность была достигнута при использовании светофильтра 620нм.

Заключение: предложенный способ получения антигена P. multocida и его использования в реакции иммунотурбидиметрии характеризуется значительной простотой  исполнения и достаточной специфичностью для использования в ветеринарной практике.

Summary

Mining of reacting immunoturbidimetry for detection of antibodies to micro-organisms of a genus Pasteurella.

Afonjushkin V.N., Zubritskaja I.A.

The way of deriving of an antigene РМ and also method of application of its usage in reacting immunoturbidimetry described by a considerable simplicity of fulfilment and sufficient specificity for usage in veterinary practice is proposed.